V procese vykonávania genetických štúdií sa často stretávame s nedostatočnými vzorkami RNA, napríklad na štúdium drobných anatomických nádorov ústnej dutiny, dokonca aj jednobunkových vzoriek a vzoriek špecifických génových mutácií, ktoré sú v ľudských bunkách prepisované na veľmi nízkych úrovniach.Samozrejme, v prípade testu na COVID-19, ak tampóny nie sú na správnom mieste alebo nie je dostatok času počas odberu vzoriek, veľkosť vzorky bude veľmi nízka, a preto Komisia pre zdravie a plánovanie rodiny vyšla pred dvoma dňami a prešiel testom a ak vzorkovač nukleových kyselín neodobral šesť vzoriek, môžete to nahlásiť.
Citlivosť činidla je dôležitá, pretože máme tento alebo iný problém, takže čo môžeme urobiť na zlepšenie citlivosti RT-PCR?
Predtým, ako si rozoberieme možné riešenia, spomeňme dve veľké komplikácie so situáciou, ktorú sme práve spomenuli.
V prvom rade sa obávame straty RNA, keď máme vo vzorke len niekoľko bunkových populácií.Ak sa použijú tradičné separačné a čistiace metódy, ako je kolónová metóda alebo metóda zrážania nukleových kyselín, existuje vysoká pravdepodobnosť, že sa tých niekoľko vzoriek stratí.Jedným z riešení je pridať molekulu nosiča, ako je tRNA, ale ani potom nie je zaručené, že náš experiment s obnovou je v poriadku.
Aký je teda lepší spôsob?Dobrou možnosťou pre kultivované bunky alebo mikroanatomické vzorky je použiť priamu lýzu.
Cieľom je rozdeliť bunky na 5 minút, uvoľniť RNA do roztoku, potom zastaviť reakciu na 2 minúty, potom pridať lyzát priamo do reakcie reverznej transkripcie, aby sa nestratila žiadna RNA, a nakoniec priamo vložiť výslednú cDNA. do reakcie v reálnom čase.
Ale čo ak kvôli obmedzenému počiatočnému bodu alebo malému množstvu expresie cieľového génu môžeme recyklovať všetku RNA a stále neposkytovať dostatok šablón na získanie dobrého signálu v reálnom čase?
V tomto prípade môže byť veľmi užitočný krok predamplifikácie.
Nasleduje schéma na zvýšenie citlivosti po reverznej transkripcii.Predtým, ako začneme, sa musíme opýtať, o ktoré ciele máme záujem, aby sme pre tieto ciele navrhli špecifické priméry na predamplifikáciu.
To sa dá dosiahnuť vytvorením zmiešaného priméru s až 100 pármi primérov a 10 až 14-násobným reakčným cyklom.Preto je na predamplifikáciu získanej cDNA potrebná Master Mix špeciálne navrhnutá pre túto požiadavku.
Dôvodom pre nastavenie počtu cyklov medzi 10 a 14 je, že tento obmedzený počet cyklov zabezpečuje náhodnosť medzi rôznymi cieľmi, čo je kľúčové pre výskumníkov, ktorí potrebujú kvantitatívne molekulárne informácie.
Po predamplifikácii môžeme získať veľké množstvo cDNA, takže citlivosť detekcie na back-ende sa výrazne zlepší a môžeme dokonca zriediť vzorku a vykonať viacero reakcií PCR v reálnom čase, aby sme eliminovali možné náhodné chyby.
Čas odoslania: 11. apríla 2023